Elabscience®自主研發(fā)的 Annexin V-APC/PI Apoptosis Kit，可用于檢測懸浮細胞和貼壁細胞的凋亡。 Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸 (PS) 有高度親和力。當細胞發(fā)生 凋亡時，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被熒光染料 APC 標記的 Annexin V 結(jié)合，可 通過流式細胞儀或熒光顯微鏡進行檢測。 由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可與雙鏈 DNA 特異 性結(jié)合并產(chǎn)生強烈的熒光，與 Annexin V 搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細胞。 本試劑盒檢測喜樹堿誘導(dǎo)的 Jurkat 細胞凋亡效果如下圖所示：

實驗操作：

一步法

1．細胞按照實驗方案進行凋亡誘導(dǎo)，300×g 離心5 min，棄上清，收集細胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細胞并計數(shù)。

2．取1~5×105重懸的細胞，300×g離心5min，棄上清。用 PBS 洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入500μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞。

3．細胞懸液中加入5μL的 Annexin V-APC Reagent和5μL的PI Reagent (50μg/mL)。

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育 15~20 min。

5．立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內(nèi)完成檢測。

注：流式細胞儀檢測時Annexin V-APC可用APC通道，PI優(yōu)先選擇 ECD 通道，其次是 PE 通道；如果樣本有 FITC通道的自發(fā)熒光，則選PerCP/Cy5.5 通道。

兩步法

1．細胞按照實驗方案進行凋亡誘導(dǎo)，300×g離心5 min，棄上清，收集細胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細胞并計數(shù)。

2．取1~5×105重懸的細胞，300×g離心5min，棄上清。用PBS洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入100μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞。

3．細胞懸液中加入2.5μL的Annexin V-APC Reagent和2.5μL的PI Reagent (50μg/mL)。（由于兩步法分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶亦可根據(jù)自己的模型進行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質(zhì)量的結(jié)果。）

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育 15~20 min。

5．加入400μL稀釋的 1×Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內(nèi)完成檢測。

注：流式細胞儀檢測時Annexin V-APC可用APC通道，PI優(yōu)先選擇ECD通道，其次是PE通道；如果樣本有FITC 通道的自發(fā)熒光，則選擇PerCP/Cy5.5通道。

注意事項：

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。

2. 檢測貼壁細胞時，需收集誘導(dǎo)凋亡后產(chǎn)生的懸浮細胞，并與后續(xù)收集的貼壁細胞一起檢測。

3. 應(yīng)盡量避免消化貼壁細胞帶來的機械損傷。同時，胰酶的消化液中應(yīng)盡量不含 EDTA，因為 EDTA

會影響 Annexin V 與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

4. 如果使用含 EDTA 的胰酶，收集細胞后應(yīng)充分清洗，確保 EDTA 被去除干凈。

5. 染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。

6. 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡

量注意避光保存。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

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