產(chǎn)品名稱：碧云天beyotime酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒(D0029)現(xiàn)貨供應(yīng)

產(chǎn)品貨號(hào)：D0029

產(chǎn)品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1.取培養(yǎng)過夜的酵母1.5毫升，5000g離心1分鐘收集酵母沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升培養(yǎng)過夜的酵母。再在離心機(jī)快速離心一下(5000g離心1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。

通常酵母宜30°C培養(yǎng)過夜(16-24小時(shí)左右)。建議5000g(～5000-6000rpm)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時(shí)間。時(shí)間過長或離心速度過快會(huì)使沉淀過于緊密，不利于后續(xù)加入溶液I后充分重懸沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升酵母液并重復(fù)上述的離心操作，然后直接倒掉上清，再在離心機(jī)快速離心一下(5000g 1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。殘余液體必須吸盡，否則可能會(huì)干擾后續(xù)的酶解反應(yīng)。如果酵母密度明顯偏低，可考慮使用更多酵母液，再重復(fù)上述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超過5ml。過量的酵母會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的酶解和堿裂解不充分。

2.每管加入100微升酶解緩沖液，重懸酵母沉淀。確保沉淀散開，無可見酵母團(tuán)塊。

可以通過劇烈Vortex來重懸沉淀。

3.加入20微升配制好的Lyticase溶液，充分混勻，30℃水平搖床200-250rpm孵育0.5-1小時(shí)。

注意：根據(jù)酵母菌株和酵母細(xì)胞數(shù)量的不同，酶解的孵育時(shí)間可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。當(dāng)酵母用量較大時(shí)，酶解的孵育時(shí)間需延長。孵育時(shí)間延長到2-3小時(shí)通常不會(huì)對質(zhì)粒抽提帶來負(fù)面影響。

4.1500g (～3000-4000rpm)離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

直接倒掉上清，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。也可在直接倒掉上清后再在離心機(jī)內(nèi)甩一下，用移液器吸盡殘留液體。不同離心機(jī)因離心半價(jià)的不同g和rpm的換算值有所不同。

5.每管加入250微升溶液I，重懸酵母沉淀。確保沉淀散開，無可見酵母團(tuán)塊。

確認(rèn)溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。由于此時(shí)酵母細(xì)胞壁已經(jīng)去除，重懸操作要溫和，不宜劇烈振蕩，否則會(huì)容易導(dǎo)致基因組DNA的污染。但同時(shí)必須保證沉淀充分散開，即必須確保酵母細(xì)胞充分分散到溶液中。

6.每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。遇到有少量團(tuán)塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不可超過5分鐘。

7.每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。

切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。

8.最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。

離心后會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。離心時(shí)準(zhǔn)備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標(biāo)記。

9.將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。最高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。

質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

10.在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。

加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

11.最高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇揮發(fā)。

注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。

12.將質(zhì)粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。

溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V沾在管壁上，一定要震動(dòng)管子，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q級(jí)純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時(shí)間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。

13. 最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度酵母質(zhì)粒。

相關(guān)文獻(xiàn)：

[1]Wang M, Wang L, Guo Y, Sun R, Yue F, Yi Q, Song L. . The broad pattern recognition spectrum of the Toll-like receptor in mollusk Zhikong scallop Chlamys farreri. Dev Comp Immunol. 2015 Oct;52(2):192-201. (IF 3.192);

[2]Wang Z, Yu X, Niu X, Yang J, Tang Y, Hu J, Diao Y . Screening of the proteins interacting with NS1 of TMUV by yeast two-hybrid system and the identification of the function of the interacted protein. Infect Genet Evol. 2018 Sep;63:277-284. (IF 2.773);

[3]Wang Y, Zhang S, Tang Y, Diao Y . Screening of Duck Tembusu Virus NS3 Interacting Host Proteins and Identification of Its Specific Interplay Domains. VIRUSES-BASEL. 2019 Aug 12 11(8). pii: E740. (IF 3.816);

[4]Hui Wang, Wenrui Zhang, Rujiao Liu, Jiaoyun Zheng, Xueping Yao, Hui Chen, Jie Wang, Horst Christian Weber, Xiaoqun Qin, Yang Xiang, Chi Liu, Huijun Liu, Lang Pan, Xiangping Qu . Lack of bombesin receptor-activated protein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice Life Sci Alliance. 2022 Jul 12;5(11):e202201368. doi: 10.26508/lsa.202201368.

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