一、 試劑盒概述與原理

  產(chǎn)品名稱： E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit

  貨號(hào)： D6492

  用途： 用于快速純化PCR、酶切、標(biāo)記等反應(yīng)后的DNA產(chǎn)物，去除引物、引物二聚體、dNTPs、鹽離子、酶等雜質(zhì)。

  原理： 基于 硅膠柱（HiBind® DNA Mini Column） 技術(shù)。在高鹽條件下，DNA會(huì)特異性地吸附到硅膠膜上，而雜質(zhì)則被洗脫。隨后在低鹽緩沖液中將純凈的DNA洗脫下來(lái)。

  特點(diǎn)：

      快速： 整個(gè)過(guò)程可在15-20分鐘內(nèi)完成。

      高效： 對(duì)100bp至10kb的DNA片段回收率高。

      高純度： 純化后的DNA可直接用于測(cè)序、克隆、酶切、連接等下游實(shí)驗(yàn)。

二、 試劑盒組成（以D6492-01為例，100次預(yù)裝）

請(qǐng)?jiān)谑褂们昂藢?duì)以下試劑是否齊全且充足：

1.  CP Buffer： 結(jié)合緩沖液（含高濃度離液鹽）。

2.  DNA Wash Buffer（濃縮液）： 漂洗液，使用前必須按說(shuō)明書(shū)要求加入無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋（通常是在整瓶中加入指定體積的無(wú)水乙醇）。

3.  Elution Buffer： 洗脫液（10 mM Tris-HCl， pH 8.5）。也可使用無(wú)菌去離子水（pH > 7.0）代替，但用Elution Buffer洗脫效率通常更高。

4.  HiBind® DNA Mini Columns： 吸附柱（2 mL）及收集管（2 mL）。

5.  說(shuō)明書(shū)。

三、 標(biāo)準(zhǔn)操作流程

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

  將DNA Wash Buffer按說(shuō)明書(shū)要求用無(wú)水乙醇稀釋。

  將CP Buffer和Elution Buffer置于室溫融化。

  準(zhǔn)備好無(wú)水乙醇。

第一步：平衡結(jié)合條件

1.  向您的PCR反應(yīng)液中加入5倍體積的CP Buffer（例如，50μL PCR產(chǎn)物 + 250μL CP Buffer）。

2.  用移液器充分吹打混勻。

第二步：DNA結(jié)合

1.  將混合物全部轉(zhuǎn)移到HiBind® DNA Mini Column中（柱子裝在2mL收集管內(nèi)）。

2.  室溫（15-25°C），≥10,000 x g 離心 30-60秒。

3.  棄去收集管中的濾液，將柱子放回同一收集管中。

第三步：漂洗

1.  向柱子中加入 700μL DNA Wash Buffer（已含乙醇?。?。

2.  室溫，≥10,000 x g 離心 30-60秒。

3.  棄濾液，將柱子放回收集管。

4.  重復(fù)步驟1-3一次（即總共用Wash Buffer漂洗兩次）。

5.  空離以cedi去除殘留乙醇： 將空柱以最大轉(zhuǎn)速（≥13,000 x g）離心 2分鐘。這一步至關(guān)重要，因?yàn)闅埩舻囊掖紩?huì)嚴(yán)重影響下游酶促反應(yīng)。

第四步：洗脫DNA

1.  將柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的、干凈的 1.5mL 離心管中。

2.  向柱子硅膠膜的正中央，懸空滴加 15-30μL Elution Buffer（或無(wú)菌水）。

3.  室溫靜置 2-5分鐘，使緩沖液充分浸潤(rùn)膜。

4.  室溫，≥10,000 x g 離心 1分鐘。離心管底部的液體即為您純化后的DNA。

5.  （可選，用于提高得率） 將離心得到的洗脫液重新加回柱子吸附膜中央，再次離心1分鐘。

四、 關(guān)鍵要點(diǎn)與經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1.  比例是關(guān)鍵： “PCR產(chǎn)物：CP Buffer = 1：5" 這個(gè)比例必須遵守。這是保證DNA高效結(jié)合到柱上的前提。如果產(chǎn)物體積很小，可以先用無(wú)菌水補(bǔ)足到一定體積（如50μL）再加CP Buffer。

2.  乙醇是必須的： 使用前務(wù)必確認(rèn) DNA Wash Buffer 已加入正確量的無(wú)水乙醇。未加乙醇的Wash Buffer無(wú)法有效去除鹽分。

3.  cedi去除乙醇： 最后的 “空離2分鐘" 步驟絕對(duì)不能省略。殘留的乙醇會(huì)抑制后續(xù)的酶（如連接酶、測(cè)序酶等）活性。離心后可以打開(kāi)柱子蓋，在室溫下再放置幾分鐘讓殘余乙醇wanquan揮發(fā)。

4.  提高洗脫效率：

      預(yù)熱Elution Buffer： 將洗脫液預(yù)熱至65°C或更高溫度，可以顯著提高DNA的洗脫效率，從而提高最終得率。

      洗脫體積： 洗脫體積越小，濃度越高，但總得率可能會(huì)略有下降。根據(jù)下游應(yīng)用需求平衡。對(duì)于測(cè)序，通常用15-20μL洗脫；對(duì)于需要高濃度DNA的應(yīng)用，可以嘗試用10μL洗脫。

5.  關(guān)于DNA片段大?。?該試劑盒適用于100bp - 10kb的片段。對(duì)于非常小的片段（如<100bp的引物二聚體），在高鹽條件下結(jié)合效率較低，因此可以被有效去除。對(duì)于非常大的片段（>10kb），結(jié)合和洗脫效率會(huì)下降，需酌情增加結(jié)合和洗脫時(shí)間。

五、 下游應(yīng)用

純化后的DNA適用于：

  Sanger測(cè)序

  限制性內(nèi)切酶消化

  連接與克隆

  體外轉(zhuǎn)錄/翻譯

  下一代測(cè)序（NGS）文庫(kù)構(gòu)建等。

六、常見(jiàn)問(wèn)題排查

Omega代理——天津益元利康生物科技有限公司

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