一、MLPA核心原理一句話概括

MLPA通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特殊的、靶向相鄰DNA序列的探針，只有當(dāng)這對(duì)探針同時(shí)與靶序列wanmei結(jié)合時(shí)，才能連接成一個(gè)完整的模板，隨后被通用引物擴(kuò)增并定量。擴(kuò)增產(chǎn)物的量直接反映了靶序列的拷貝數(shù)。

二、 MLPA檢測(cè)原理分步詳解

下面，我們來(lái)詳細(xì)解讀流程中的每一個(gè)關(guān)鍵步驟：

 第1步：探針雜交

   一對(duì)探針：針對(duì)每一個(gè)待檢測(cè)的靶位點(diǎn)，都設(shè)計(jì)有兩條非常短的寡核苷酸探針。

       左探針：包含一段靶序列特異性雜交序列 + 一段通用的“引物結(jié)合"序列X。

       右探針：包含一段靶序列特異性雜交序列 + 一段長(zhǎng)度不等的“填充序列" + 一段通用的“引物結(jié)合"序列Y。

   特異性結(jié)合：將這一對(duì)探針與變性后的樣本DNA混合。它們會(huì)尋找并精確地雜交到目標(biāo)DNA上相鄰的位置（通常只間隔1個(gè)核苷酸）。

 第2步：連接反應(yīng)（最關(guān)鍵的一步）

   “連接依賴"的核心：只有當(dāng)左、右探針都wanmei地與靶DNA結(jié)合并緊密相鄰時(shí)，連接酶才能將它們共價(jià)連接成一條完整的、長(zhǎng)的DNA模板。

   嚴(yán)苛的質(zhì)控：如果靶序列缺失（拷貝數(shù)為0）或發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致探針無(wú)法結(jié)合，連接反應(yīng)就不會(huì)發(fā)生。這確保了后續(xù)信號(hào)的特異性，避免了假陽(yáng)性。

 第3步：PCR擴(kuò)增

   通用引物擴(kuò)增：使用一對(duì)針對(duì)所有連接產(chǎn)物上通用序列X和Y的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

   產(chǎn)物長(zhǎng)度各異：由于每個(gè)右探針的“填充序列"長(zhǎng)度不同，因此每個(gè)靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的最終PCR產(chǎn)物都具有獨(dú)特的長(zhǎng)度（就像不同大小的“條形碼"）。

 第4步：毛細(xì)管電泳分離與定量

   按長(zhǎng)度分離：將所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，嚴(yán)格按照片段長(zhǎng)度進(jìn)行分離。

   熒光檢測(cè)：PCR引物或探針上標(biāo)記有熒光基團(tuán)，因此每個(gè)長(zhǎng)度的片段會(huì)產(chǎn)生一個(gè)熒光信號(hào)峰。

 第5步：數(shù)據(jù)分析

   峰高/面積 = 相對(duì)拷貝數(shù)：通過(guò)軟件分析每個(gè)峰的高度或面積。將其與同一反應(yīng)中多個(gè)內(nèi)參基因（已知為二倍體，拷貝數(shù)穩(wěn)定）的峰進(jìn)行比較。

   結(jié)果解讀：

       正常拷貝數(shù)（2份）：靶位點(diǎn)峰高與內(nèi)參峰高比值約為1.0。

       缺失（1份或0份）：比值約為0.5或0。

       重復(fù)/擴(kuò)增（3份或以上）：比值約為1.5或更高。

三、 MLPA原理的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

1.  高通量：?jiǎn)未畏磻?yīng)可輕松檢測(cè)40-50個(gè)不同的靶位點(diǎn)。

2.  高特異性與準(zhǔn)確性：依賴“雙探針wanmei結(jié)合"的連接步驟，如同雙重校驗(yàn)，極大減少了非特異性擴(kuò)增。

3.  對(duì)DNA質(zhì)量要求低：因?yàn)樘结樅芏蹋?/span>~50-70 nt），即使DNA部分降解（如FFPE樣本），也能有效雜交和連接，而長(zhǎng)片段PCR則會(huì)失敗。

4.  可檢測(cè)甲基化（MS-MLPA）：通過(guò)對(duì)右探針的雜交序列進(jìn)行HhaI酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)。如果靶序列被甲基化，酶切被阻止，探針可連接擴(kuò)增；如果未甲基化，酶切斷開(kāi)探針，無(wú)法擴(kuò)增。通過(guò)比較酶切處理與未處理的信號(hào)，即可判斷甲基化狀態(tài)。

四、與其他技術(shù)的核心區(qū)別

總結(jié)來(lái)說(shuō)，MLPA的原理精髓在于其“連接依賴"和“長(zhǎng)度編碼"的設(shè)計(jì)，使其成為檢測(cè)已知基因拷貝數(shù)變異和甲基化的一種高度多重、精準(zhǔn)且經(jīng)濟(jì)高效的技術(shù)，特別適用于臨床診斷和大規(guī)模篩查。

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