核心特點(diǎn)： Lipo3000 是陽離子脂質(zhì)體試劑，其配方中包含專屬的 P3000™ 增強(qiáng)劑，能顯著提高轉(zhuǎn)染效率，尤其對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染效果出色。其操作是將脂質(zhì)體與DNA分別稀釋后再混合，簡化了流程。

一、標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染步驟（以24孔板為例）

以下步驟可按比例放大或縮小。

 材料準(zhǔn)備

- Lipofectamine 3000 試劑

- P3000™ 增強(qiáng)劑（隨試劑盒提供）

- 待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA

- Opti-MEM® 或其它無血清培養(yǎng)基（必須使用，不能用wan全培養(yǎng)基或PBS）

- 狀態(tài)良好、密度約70-90%的細(xì)胞（具體zui-佳密度需根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化）

- 無抗生素的wan全培養(yǎng)基（轉(zhuǎn)染前后更換）

 實(shí)驗(yàn)前一日：細(xì)胞鋪板

將細(xì)胞接種于24孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到 70-90% 匯合度。使用正常的wan全培養(yǎng)基。

 轉(zhuǎn)染當(dāng)日（以每孔計(jì)算）

A. 溶液配制（使用前輕輕混勻各試劑，切勿渦旋）

1.  稀釋質(zhì)粒DNA溶液：

       取一支無菌離心管，加入 50 µL Opti-MEM 培養(yǎng)基。

       加入 0.5 - 1.0 µg 質(zhì)粒DNA（zui-佳用量需優(yōu)化）。

       加入 1 µL P3000™ 增強(qiáng)劑。輕輕吹打或輕彈管壁混勻，室溫孵育5分鐘（可選，但推薦）。

2.  稀釋Lipofectamine 3000試劑：

       取另一支無菌離心管，加入 50 µL Opti-MEM 培養(yǎng)基。

       加入 1.5 µL Lipofectamine 3000 試劑。立即輕輕吹打或輕彈混勻（脂質(zhì)體容易沉降）。室溫靜置 5分鐘。

B. 形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物

   將 稀釋好的DNA溶液（步驟A1） 全部加入 含有稀釋脂質(zhì)體的管子（步驟A2） 中。

   輕輕吹打混勻 或 輕彈管壁混勻。切勿渦旋。

   室溫靜置 10-15分鐘，讓復(fù)合物穩(wěn)定形成。溶液可能會(huì)輕微渾濁，這是正常現(xiàn)象。

C. 將復(fù)合物加入細(xì)胞

   將 100 µL 的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物溶液，逐滴均勻地加入到含細(xì)胞的孔中。

   輕輕前后左右搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物分布均勻。

   將細(xì)胞放回37°C，5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

D. 換液與檢測（時(shí)間點(diǎn)需優(yōu)化）

   轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果脂質(zhì)體毒性較大，此時(shí)應(yīng)更換為新鮮的wan全培養(yǎng)基（可含抗生素）。

   如果細(xì)胞狀態(tài)良好，也可不換液繼續(xù)培養(yǎng)。

   在轉(zhuǎn)染后 24-72小時(shí)（取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛨?bào)告基因）進(jìn)行蛋白或mRNA水平的檢測。

二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與優(yōu)化建議

1.  細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要：使用低傳代、生長旺盛的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞必須處于對(duì)數(shù)生長期。

2.  無血清與無抗生素：配制復(fù)合物必須使用 Opti-MEM。轉(zhuǎn)染前后培養(yǎng)基應(yīng)不含抗生素，以減少細(xì)胞毒性和干擾。

3.  試劑輕柔混勻：Lipofectamine 3000 和形成的復(fù)合物都不能渦旋，劇烈操作會(huì)破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。

4.  DNA純度要求高：使用內(nèi)毒素低、純度高的質(zhì)粒（OD260/280 ≈ 1.8-2.0）。

5.  比例優(yōu)化：shou ci實(shí)驗(yàn)必須進(jìn)行劑量優(yōu)化。優(yōu)化兩個(gè)變量：

       DNA用量：通常在0.25 µg - 1.5 µg/孔（24孔板）之間測試。

       Lipofectamine 3000 用量：與DNA的比例（µL : µg）通常在 1:1 到 3:1 之間測試（例如，0.5 µg DNA 搭配 0.5 µL， 1.0 µL， 1.5 µL試劑）。

6.  P3000™增強(qiáng)劑：其用量與DNA量成正比（通常為 2 µL/µg DNA），但也可以微調(diào)。

7.  陰性對(duì)照：務(wù)必設(shè)置只加脂質(zhì)體復(fù)合物（不含DNA）的對(duì)照組，以評(píng)估脂質(zhì)體本身的細(xì)胞毒性。

8.  復(fù)合物孵育時(shí)間：10-15分鐘足夠，過長（如>30分鐘）可能降低效率。

三、簡明步驟總結(jié)

1.  鋪板：細(xì)胞達(dá)70-90%匯合。

2.  配液A：Opti-MEM + DNA + P3000，混勻。

3.  配液B：Opti-MEM + Lipo3000，混勻，靜置5分鐘。

4.  混合：將A加入B，混勻，室溫靜置10-15分鐘。

5.  加樣：將復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞，輕柔混勻。

6.  培養(yǎng)：4-6小時(shí)后換液（視情況），繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)檢測。

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