那么它具體怎么培養(yǎng)呢？

一、IPSC培養(yǎng)之實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

   試劑：預(yù)熱的無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)基（如mTeSR™ Plus， E8）、基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板、解離試劑（如 Gentle Cell Dissociation Reagent， 不含酶）、PBS、ROCK抑制劑（Y-27632）。

   設(shè)備：37°C， 5% CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)。

二、IPSC培養(yǎng)之基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板

   用預(yù)冷的PBS或無(wú)血清DMEM按說(shuō)明書(shū)比例稀釋基質(zhì)膠。

   迅速將稀釋液加入培養(yǎng)板中（6孔板約1 mL/孔），室溫靜置至少1小時(shí)或4℃過(guò)夜。

   使用前吸棄包被液，無(wú)需晾干，直接接種細(xì)胞。

三、IPSC培養(yǎng)之日常觀察與換液

   每日觀察：在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。健康的iPSC克隆應(yīng)邊界清晰、細(xì)胞核大、核質(zhì)比高、克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密。邊緣出現(xiàn)扁平、拉長(zhǎng)或透明的細(xì)胞是分化的征兆。

   換液：每天換液一次。輕柔吸棄舊培養(yǎng)基，沿孔壁緩慢加入預(yù)溫的新鮮培養(yǎng)基，避免吹打克隆。

四、IPSC培養(yǎng)之傳代（關(guān)鍵步驟）

iPSC通常每4-7天傳代一次，當(dāng)克隆大到開(kāi)始互相接觸時(shí)進(jìn)行。

   方案A：酶解法（EDTA或Accutase）：

    1.  吸棄培養(yǎng)基，用PBS輕柔清洗一次。

    2.  加入適量含0.5 mM EDTA的PBS或Accutase，37℃孵育3-5分鐘。

    3.  在顯微鏡下觀察，當(dāng)克隆邊緣開(kāi)始卷起、細(xì)胞間隙變大時(shí)，迅速吸棄解離液。

    4.  加入含10 μM ROCK抑制劑的完全培養(yǎng)基，用1mL移液器輕柔吹打成小團(tuán)塊（約幾十到幾百個(gè)細(xì)胞一團(tuán)）。切忌吹成單細(xì)胞！

    5.  離心，重懸，按適當(dāng)比例（通常1:6至1:20）接種到新包被的板上。

   方案B：手動(dòng)挑克隆法：

       用于去除分化部分、單克隆篩選或處理珍貴細(xì)胞系。

       在顯微鏡下用拉細(xì)的巴斯德管或?qū)Ｓ锰翎?，物理刮取未分化的克隆區(qū)域，轉(zhuǎn)移至新孔。

   關(guān)鍵點(diǎn)：傳代后24小時(shí)內(nèi)，在培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑，可顯著提高克隆形成率和存活率。

五、IPSC培養(yǎng)之凍存與復(fù)蘇

   凍存：使用適合無(wú)血清培養(yǎng)的專(zhuān)用凍存液（如CryoStor® CS10），或含10% DMSO + 30%血清替代物 + 60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基的自配凍存液。以小團(tuán)塊形式凍存。

   復(fù)蘇：

    1.  快速解凍細(xì)胞。

    2.  用含大量ROCK抑制劑的培養(yǎng)基重懸并接種。

    3.  24小時(shí)后全量換液為正常培養(yǎng)基。

六、 常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策

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