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怎么解決細(xì)胞被污染的問(wèn)題？
2024-11-26
從事細(xì)胞培養(yǎng)工作時(shí)都有可能面臨細(xì)胞受到污染的境況。對(duì)于細(xì)胞的受污染問(wèn)題，最為緊要的在于防范，因?yàn)橐坏┘?xì)胞受到污染，欲挽回已十分艱難，即便成功挽回，細(xì)胞的狀態(tài)亦會(huì)受損，進(jìn)而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。怎么解決細(xì)胞被污染的問(wèn)題？把細(xì)胞污染分為早期污染和晚期污染兩種情況。早期污染是細(xì)胞狀態(tài)變差，但依舊能保持生長(zhǎng)，顯微鏡下未見(jiàn)明顯微生物或可見(jiàn)少量微生物。這種情況的話我們?cè)趽Q液時(shí)可以多用PBS洗幾次，然后加入適合的抗生素。早期污染只要發(fā)現(xiàn)及時(shí)，處理得當(dāng)，救回來(lái)的可能性還是很大的。晚期污染則是細(xì)...
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PCR buffer基本組分
2024-11-25
一、buffer是干什么的？PCRbuffer（緩沖液）的作用就是給Taq酶提供一個(gè)最適的反應(yīng)條件。一般含有Tris－HCL，Mgcl2+等成分。不同的pcrbuffer成分可能不一樣。二、buffer基本組分1、Tris-HCl：具有良好的緩沖能力和對(duì)多種酶的兼容性，在PCR中的主要作用是調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使PCR反應(yīng)過(guò)程維持在一個(gè)穩(wěn)定的ph范圍內(nèi)；為酶反應(yīng)提供恒定的酸堿環(huán)境，保持酶的活性，確保PCR擴(kuò)增的順利進(jìn)行。2、K+：主要發(fā)揮穩(wěn)定酶活性和參與模板DNA的解鏈作用...
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如何降低非特異性擴(kuò)增？
2024-11-25
一、擴(kuò)增方式擴(kuò)增方式一般有兩種，對(duì)稱擴(kuò)增和不對(duì)稱擴(kuò)增。1、對(duì)稱擴(kuò)增使用等量的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物量隨著PCR循環(huán)呈指數(shù)增長(zhǎng)，一般的PCR，使用的都是這種方式。由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR擴(kuò)增的過(guò)程中會(huì)水解探針，導(dǎo)致探針被耗盡，無(wú)法用于熔曲分析；若使用抗酶切修飾的探針，可一定程度降低水解，但由于探針阻礙了聚合酶通過(guò)，擴(kuò)增效率會(huì)大幅下降。對(duì)稱擴(kuò)增產(chǎn)生的互補(bǔ)雙鏈，會(huì)與探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶序列，不利于探針結(jié)合到靶序列上，熔曲分析可能會(huì)出現(xiàn)異常。優(yōu)點(diǎn)：靈敏...
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病毒滴度的單位有哪些？
2024-11-22
一、病毒滴度病毒的滴度：?jiǎn)挝惑w積(通常為mL)液體中具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。滴度是一個(gè)病毒自身復(fù)制的數(shù)量概念，可分為物理滴度和感染滴度。物理滴度是指包含病毒基因組的病毒顆粒的濃度，可以通過(guò)通過(guò)定量PCR對(duì)病毒顆粒的基因組拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，也可以通過(guò)測(cè)定病毒顆粒中的特定蛋白進(jìn)行定量，但物理滴度未考慮到病毒活性和感染效率，因此是不準(zhǔn)確的。感染滴度是指成功轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的病毒顆粒的濃度，須通過(guò)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定，如利用定量PCR對(duì)細(xì)胞中的病毒基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，或通過(guò)攜帶熒光的病毒感染細(xì)...
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IHC染色不均勻分析
2024-11-22
上次我們分享了IHC未染色或無(wú)信號(hào)的原因分析，這次讓我們來(lái)看看IHC染色不均勻是為什么吧。一、組織切片制備解釋：組織切片薄厚不均勻→建議：更換刀片二、組織固定1.解釋：酒精固定不足會(huì)產(chǎn)生偽影；→建議：延長(zhǎng)固定時(shí)間；嘗試不同的固定液2.解釋：固定延遲導(dǎo)致抗原擴(kuò)散；建議：立即固定組織；可以考慮使用交聯(lián)固定劑三、脫蠟解釋：脫蠟不wan全→建議：使用新鮮的二甲苯四、抗體兼容性解釋：一抗可能結(jié)合其他抗原上的表位→建議：從多抗切換至單抗；嘗試不同的單抗五、透化解釋：細(xì)胞膜被破壞，膜蛋白丟...
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IHC未染色或無(wú)信號(hào)原因分析
2024-11-21
IHC未染色或無(wú)信號(hào)的原因：一、?抗體問(wèn)題?：抗體與一抗或二抗不兼容、抗體濃度不合適、抗體失效或儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)榷紩?huì)導(dǎo)致無(wú)染色。例如，使用抗一抗種屬來(lái)源的二抗，確認(rèn)二抗是否識(shí)別一抗的亞型；使用更高濃度的抗體或延長(zhǎng)孵育時(shí)間；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，確?？贵w仍然有效?。二、?抗原修復(fù)不足?：固定步驟可能會(huì)改變抗體識(shí)別的抗原表位，導(dǎo)致抗原修復(fù)不足。使用微波或壓力鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，確保使用新鮮配置的修復(fù)液?。三、?樣本處理不當(dāng)?：樣本存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、切片制備不當(dāng)（如脫蠟不ce底）、組織切片干片等都會(huì)影響...
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蛋白芯片是什么？
2024-11-21
一、蛋白芯片簡(jiǎn)介?蛋白芯片?是一種高通量的蛋白質(zhì)功能分析檢測(cè)技術(shù)，主要用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。其基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載體上，然后利用標(biāo)記了特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)的表達(dá)數(shù)量和相互作用關(guān)系?。二、蛋白芯片的工作原理蛋白芯片通過(guò)將已知的蛋白質(zhì)分子固定在固相載體上，然后捕獲與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白質(zhì)。這些待測(cè)蛋白質(zhì)可能存在于血清、血漿、尿液等生物樣本中。通過(guò)洗滌和純化步驟后，利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術(shù)測(cè)定各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度...
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如何提取細(xì)胞核蛋白？
2024-11-20
本文介紹一下用勻漿器研磨法提取貼壁細(xì)胞核蛋白的具體操作。一、前期準(zhǔn)備1、臺(tái)盼藍(lán)染液：取臺(tái)盼藍(lán)粉劑，將其溶解在10mL的雙蒸水當(dāng)中配制成質(zhì)量體積比為4%（4%w/v）的臺(tái)盼藍(lán)母液。在使用時(shí)，利用PBS緩沖液將母液稀釋10倍，使其濃度達(dá)到0.4%，之后再與細(xì)胞懸液混合均勻。2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值為7.9）、1.5mmol/L的氯化鎂、10mmol/L的KCL、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。若擔(dān)心漿蛋白降解會(huì)對(duì)核蛋白產(chǎn)生影響...
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